Recombinant Culicoides obsoletus complex allergens stimulate antigen-specific T cells of insect bite hypersensitive Shetland ponies invitro

BackgroundPonies may suffer from Insect bite hypersensitivity (IBH), an allergic IgE-mediated pruritic skin disorder, induced by allergens from biting midges of the Culicoides spp. Hypothesis/ObjectivesTo determine whether recombinant Culicoides obsoletus allergens are able to activate T cells of ponies exposed to C.obsoletus and whether these allergen-specific responses differ between IBH-affected and healthy ponies. AnimalsTen IBH-affected Shetland ponies and 10 age-matched healthy controls taken from the same stables, to ensure similar exposure to midges. MethodPeripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured with two different pools of recombinant C.obsoletus complex allergens to expand the allergen-specific T cells. These PBMC cultures were subsequently co-cultured with mature dendritic cells (DCs) loaded with the same antigens. Induction of Th1, Th2 and regulatory T (Treg) cells in these DC/PBMC co-cultures was assessed by analysis of IFN-, IL-4, IL-10 and FoxP3 expression levels using quantitative RT-PCR and phenotyping by flow cytometry. ResultsRecombinant C.obsoletus allergens increased IFN- mRNA expression levels, percentages of IFN- expressing (Th1) cells and CD25(high)FoxP3(+)IL-10(+) Tregs compared to unstimulated DC/PBMC co-cultures. Stimulation of IL-4 expressing Th2 cells by the recombinant allergens was far less pronounced. The DC/PBMC co-cultures did not reveal significant differences between healthy and IBH-affected ponies for any of the analysed parameters, except for higher IL-4 mRNA levels in IBH affected ponies after stimulation with one of the two allergen pools. Conclusion and clinical importanceThe recombinant C.obsoletus complex allergens can stimulate antigen-specific Th1 and IL10 producing Treg cells and are therefore promising candidates for the immunotherapy of IBH. Resume ContexteLes poneys peuvent etre atteint d'hypersensibilite aux piqures d'insectes (IBH), une dermatose prurigineuse allergique mediee par les IgE, induite par les allergenes de morsures de Culicoides spp. Hypotheses/ObjectifsDeterminer si les allergenes recombinant de Culicoides obsoletus peuvent activer les cellules T de poneys exposes a C.obsoletus et si ces reponses specifiques d'allergenes different entre les poneys atteints d'IBH et les poneys sains. SujetsDix poneys Shetland atteint d'IBH et 10 temoins sains du meme age et de la meme ecurie, assurant une exposition similaire aux moucherons. MethodeLes cellules mononuclees de sang peripherique (PBMC) ont ete mises en culture avec deux differents lots d'allergenes recombinants de C.obsoletus complex pour developper les cellules T specifiques d'allergene. Ces cultures de PBMC ont ete ensuite co-cultivees avec des cellules dendritiques matures (DCs) pourvues des memes antigenes. L'induction de Th1, Th2 et T regulatrices (Treg) dans ces co-cultures de DC/PBMC etait evaluee par l'analyse des niveaux d'expression de IFN-c, IL-4, IL-10 et FoxP3 par RT-PCR quantitative et le phenotypage par cytometrie de flux. ResultatsLes allergenes recombinant de C.obsoletus augmentaient l'expression d'ARNm d'IFN-c, les pourcentages de cellules (Th1) exprimant IFN-c et Tregs CD25highFoxP3+IL-10+ compare aux co-cultures DC/PBMC non-stimulees. La stimulation des cellules Th2 exprimant IL-4 par les allergenes recombinant etait nettement moins prononcee. Les co-cultures DC/PBMC ne revelaient pas de difference significatives entre les poneys sains et les poneys atteint d'IBH pour aucun des parametres analyses a l'exception de niveaux d'ARNm d'IL-4 plus eleves chez les poneys atteints d'IBH apres stimulation avec l'un des deux pools d'allergenes. Conclusion et importance cliniqueLes allergenes recombinant de C.obsoletus complex peuvent stimuler les Th1specifiques d'antigene et les cellules Treg produisant IL10 et sont ainsi des candidats prometteurs pour l'immunotherapie de l'IBH. Resumen Introduccionlos ponies pueden sufrir hipersensibilidad por picadura de insecto (IBH), una enfermedad pruriginosa alergica de la piel mediada por IgE de inducida por alergenos de los insectos picadores del genero Culicoides. Hipotesis/Objetivosdeterminar si alergenos recombinante C.obsoletus son capaces de activar los linfocitos T de ponies expuestas a C.obsoletus, y si estas respuestas especificas de alergeno difieren entre ponies afectados y ponies sanos. Animales10 ponies de raza Shetland afectados con IBH, y 10 controles sanos con edades similares tomados de los mismos establos, para asegurar una exposicion similar a los insectos. Metodosse cultivaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con dos diferentes cocteles de alergenos recombinantes C.obsoletus para expandir los linfocitos T especificos de alergenos. Estos cultivos de PBMC fueron despues co-cultivados con celulas dendriticas maduras (DC) cargadas con el mismo tipo de antigenos. Se evaluo la induccion de Th1, Th2, y linfocitos T reguladores (Treg) en los co-cultivos DC/PBMC analizando los niveles de expresion de IFN-c, IL-4, IL-10, FoxP3 mediante RT-PCR cuantitativa y fenotipado mediante citometria de flujo Resultadoslos alergenos recombinantes de C.obsoletus incrementaron la expresion de mRNA de IFN-los porcentajes de linfocitos T expresando IFN-c, y los linfocitos Treg positivos con a CD25, con expresion alta de FoxP3, y positivos IL-10 comparados con co-cultivos DC/PBMC no estimulados. La estimulacion de linfocitos Th2 expresando IL-4 por los alergenos recombinantes fue mucho menos pronunciada. Los co-cultivos de DC/PBMC no revelaron diferencias significativas entre animales sanos y animales afectados por IBH en ninguno de los parametros realizados, a excepcion de mayores niveles de mRNA de IL-4 en los ponies afectados por IBH tras la estimulacion con uno de los dos cocteles de antigeno. Conclusiones e importancia clinicael complejo de alergenos recombinante de C. obsoletus puede estimular los linfocitos Th1 especificos de antigeno y linfocitos Treg productores de IL-10 y son por tanto candidatos prometedores para la inmunoterapia de IBH. Zusammenfassung HintergrundPonys konnen an einer Insektenstichhypersenisibilitat (IBH), einer allergischen IgE-vermittelten juckenden Hauterkrankung leiden, die von Allergenen der bei ss enden Mucken der Culicoides spp. verursacht wird. Hypothese/Zielezu bestimmen, ob rekombinante Culicoides obsoletus Allergene imstande sind T Zellen von Ponys, die C. obsoletus ausgesetzt sind, zu aktivieren und herauszufinden, ob diese Allergen-spezifischen Antworten sich zwischen den IBH-betroffenen und gesunden Ponies unterscheiden. TiereEs wurden zehn IBH-betroffene Shetland Ponies und 10 altersangepasste gesunde Kontrollponies aus denselben Stallungen verwendet, um eine ahnliche Exposition zu Mucken zu gewahrleisten. MethodenEs wurden periphere mononukleare Blut-Zellen (PBMC) mit zwei unterschiedlichen Pools an rekombinanten C. obsoletus Komplexallergenen kultiviert, um die Allergen-spezifischen T Zellen zu expandieren. Diese PBMC Kulturen wurden in der Folge gleichzeitig mit reifen dendritischen Zellen (DCs) kultiviert, die mit denselben Allergenen beladen waren. Eine Induktion der Th1, Th2 und regulatorischen T (Treg) Zellen in diesen DC/PBMC Co-Kulturen wurde mittels Analyse der Exprimierungslevels von IFN-c, IL-4, IL-10 und FoxP3 mittels quantitativer RT-PCR und Phanotypisierung mittels Flowzytometrie beurteilt. ErgebnisseRekombinante C.obsoletus Allergene erhohten die mRNA Exprimierungslevels von IFN-c, sowie prozentual die IFN-c exprimierenden (Th1) Zellen und CD25highFoxP3+IL-10+tregs im Vergleich zu unstimulierten DC/PBMC Co-Kulturen. Die Stimulierung von IL-4 exprimierenden Th2 Zellen durch rekombinante Allergene war wesentlich weniger betont. Die DC/PBMC Co-Kulturen zeigten fur keine der analysierten Parameter, au ss er fur hohe IL-4 mRNA Werte bei IBH betroffenen Ponys nach der Stimulierung mit einem der beiden Allergenpools signifikante Unterschiede zwischen gesunden und IBH-betroffenen Ponys. Schlussfolgerungen und klinische BedeutungDie rekombinanten C.obsoletus Komplexallergene konnen Antigen-spezifische Th1 und IL-10 produzierende Treg Zellen stimulieren und sind daher vielversprechende Kandidaten fur eine Immuntherapie bei IBH.